腔隙性腦梗死(CLL)動(dòng)物模型

腔隙性腦梗死為缺血性腦卒中的重要一型，由腦部深穿動(dòng)脈及其分支的特殊病變所至。采用腦內(nèi)大血管注射月桂酸鈉可選擇性損傷大鼠腦穿支動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致微小動(dòng)脈內(nèi)原位血栓形成，從而建立大鼠腔隙性腦梗死模型。

(1)復(fù)制方法  雄性大鼠，體重為250～300g。經(jīng)腹腔注射戊巴妥鈉(按50～60mg/kg體重的劑量)或水合氯醛(按350～400mg/kg體重的劑量)麻醉后，剪除頸部毛發(fā)，手術(shù)區(qū)皮膚常規(guī)消毒。頸部切口，分離右側(cè)頸總、頸內(nèi)和頸外動(dòng)脈，結(jié)扎同側(cè)枕動(dòng)脈、甲狀腺上動(dòng)脈、翼腭動(dòng)脈及頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)心端。PE-50導(dǎo)管插入頸內(nèi)動(dòng)脈，向頸內(nèi)動(dòng)脈內(nèi)緩慢注入含100μg的月桂酸鈉溶液0.1ml，期間用微動(dòng)脈夾暫時(shí)夾閉頸總動(dòng)脈。術(shù)畢結(jié)扎頸內(nèi)動(dòng)脈，縫合切口，并消毒創(chuàng)面。48h后，動(dòng)物麻醉后PE-50導(dǎo)管插入頸總動(dòng)脈。第2次注射同等量的月桂酸鈉溶液于頸總動(dòng)脈，隨后結(jié)扎頸總動(dòng)脈。

(2)檢測(cè)方法和指標(biāo)

1)行為學(xué)檢測(cè)于第2次注射月桂酸鈉3d后對(duì)動(dòng)物進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè)。

①姿勢(shì)反射試驗(yàn)：距地面1m提起鼠尾，通過觀察其雙前肢的姿勢(shì)進(jìn)行評(píng)分。無神經(jīng)功能缺損者為0分，表現(xiàn)為雙前肢伸展；輕度神經(jīng)功能缺損者為1分，表現(xiàn)為左前肢貼向前胸；重度神經(jīng)功能缺損者為2分，除有1分的表現(xiàn)外，其上半身卷曲。

②肢體不對(duì)稱應(yīng)用試驗(yàn)：試驗(yàn)在直徑20cm，高30cm的圓桶中完成。正常情況下，大鼠在圓桶中用雙前肢觸及桶壁，且應(yīng)用雙側(cè)前肢的頻率應(yīng)該相等。有缺血損傷的鼠偏癱側(cè)肢體應(yīng)用較少。可應(yīng)用下列公式進(jìn)行評(píng)分。

(右前肢獨(dú)立應(yīng)用的次數(shù)－左前肢獨(dú)立應(yīng)用的次數(shù))÷(右前肢獨(dú)立應(yīng)用的次數(shù)+左前肢獨(dú)立應(yīng)用的次數(shù)+雙側(cè)前肢同時(shí)應(yīng)用的次數(shù))

2)組織學(xué)檢測(cè)  行為學(xué)測(cè)試結(jié)束后處死動(dòng)物。10％甲醛固定鼠腦，從前腦額極起，每隔2mm冠狀切片(片厚5βm)，共取5片，第3片即可包含海馬區(qū)。磷烏酸蘇木精染色(PTAH)行組織學(xué)觀察；勒克司堅(jiān)牢藍(lán)-HE染色(Luxol fast blue-HE, LFB-HE)用以進(jìn)行腦梗死面積測(cè)定；也可進(jìn)行透射電鏡技術(shù)制備成半薄片和超薄片，在電鏡下觀察。取材部位包括注藥側(cè)大腦中動(dòng)脈、海馬、皮質(zhì)和丘腦區(qū)域。

(3)檢測(cè)結(jié)果

1)行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示  在姿勢(shì)反射試驗(yàn)中，70％以上的動(dòng)物出現(xiàn)輕、重度神經(jīng)功能缺損。在肢體不對(duì)稱應(yīng)用試驗(yàn)中，腦損傷的動(dòng)物平均分?jǐn)?shù)明顯大于空白對(duì)照組。

2)光學(xué)顯微鏡分析  PTAH染色鏡下見部分小血管周圍間隙擴(kuò)張及周圍腦組織水腫。白質(zhì)內(nèi)穿支小動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，管腔內(nèi)血小板附壁，血小板之間纖維蛋白絲早期形成；LFB-HE染色見大鼠注藥側(cè)大腦半球的皮質(zhì)、丘腦、海馬區(qū)有多發(fā)的腔隙梗死灶，組織片染色表現(xiàn)為淡染病灶。有早、中、晚期的軟化灶，有的病灶中心囊性變。

3)超微結(jié)構(gòu)分析  大鼠注藥側(cè)大腦半球的皮質(zhì)、丘腦、海馬區(qū)可見毛細(xì)血管內(nèi)皮均有不同程度的破壞、隆起。部分管腔可見壞死脫落的內(nèi)皮細(xì)胞。毛細(xì)血管外側(cè)星形細(xì)胞足突不同程度腫脹，血腦屏障破壞，血管鄰近的神經(jīng)細(xì)胞固縮。注藥對(duì)側(cè)大腦半球毛細(xì)血管內(nèi)皮完整、無損傷，星形細(xì)胞無腫脹。注藥側(cè)大腦中動(dòng)脈內(nèi)膜光滑，內(nèi)皮細(xì)胞無破壞。

(4)模型特點(diǎn)  月桂酸鈉可選擇性損傷穿支動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，對(duì)大腦中動(dòng)脈無影響。穿支動(dòng)脈周圍間隙的增加表明月桂酸鈉對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞可能是一種直接的損害，由此而導(dǎo)致了血管通透性的增加。損傷后的小血管壁可觸發(fā)血小板黏附和聚集，與凝血系統(tǒng)共同參與血栓的形成，所形成的微血栓位于受損小動(dòng)脈的原位，且包含有纖維蛋白絲。電鏡下受損血管周圍的神經(jīng)元固縮，顯示隨后發(fā)生的小梗死灶與局部微血栓的形成有密切關(guān)系。血流在從大動(dòng)脈流向小動(dòng)脈的過程中速度是逐漸減慢的，因此推測(cè)月桂酸鈉與穿支動(dòng)脈壁之間的接觸時(shí)間大大長(zhǎng)于與大動(dòng)脈的接觸時(shí)間，這一時(shí)間的不同是造成選擇性穿支動(dòng)脈內(nèi)皮損傷的原因。月桂酸鈉損傷穿支動(dòng)脈內(nèi)皮的程度有賴于給藥劑量和給藥時(shí)間兩個(gè)因素，以100μg/次，2次注射為宜。這是造成穿支動(dòng)脈內(nèi)皮損害，并能在原位形成小梗死灶，同時(shí)對(duì)大腦中動(dòng)脈不造成損害的合適條件。

(5)比較醫(yī)學(xué)  CLI在臨床表現(xiàn)為相應(yīng)的腔隙綜合征，兩次注射月桂酸鈉的過程基本模擬臨床CLI患者急性期的發(fā)病特點(diǎn)。月桂酸鈉注射3d后大多數(shù)動(dòng)物行為學(xué)表現(xiàn)異常，這與部分患者于發(fā)病后72h左右癥狀達(dá)高峰相吻合。實(shí)驗(yàn)第6日大多數(shù)鼠有多發(fā)的小梗死灶存在，病變多分布于丘腦、海馬、皮質(zhì)，符合臨床CLI病灶的分布特點(diǎn)。梗死灶大小也符合CLl的診斷標(biāo)準(zhǔn)。此模型為研究該病的病理生理和開發(fā)針對(duì)性強(qiáng)的神經(jīng)保護(hù)劑具有的價(jià)值。