原位雜交

原位雜交

原位雜交反應（以DIG-cDNA探針為例）：

1、切片常規脫蠟至水，脫蠟前，將組織切片置于60℃恒溫箱中烘烤60min；

2、30%H2O2 1份+蒸餾水10份混合，室溫10min以滅活內源性酶，蒸餾水洗3次；

3、暴露mRNA核酸片段，切片上滴加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶，37℃消化30min，PBS洗5min X3，蒸餾水洗1次；

4、預雜交，濕盒準備——干的雜交盒底部加20%甘油以保持濕度。按每張20uL加雜交液。恒溫箱40℃ 2h，吸取多余液體；

5、雜交，按每張切片20uL探針雜交液，加在切片上。將蓋玻片蓋在切片上，蠟蟆封蓋，恒溫箱42℃雜交；

6、雜交后洗滌，去除蠟膜，揭掉蓋玻片，37℃ 2XSSC洗5min X2；37℃ 0.5XSSC洗15min X1；37℃ 0.2XSSC洗15min X1；

7、滴加封閉液，37℃ 30min；

8、滴加生物素化鼠抗地-高-辛，37℃ 60min，PBS洗5min X4；

9、滴加SABC，37℃ 30min，PBS洗5min X3；

10、滴加生物素化過氧化酶，37℃ 30min，PBS洗5min X4；

11、DAB顯色，使用DAB顯色試劑盒，顯色10min左右，顯色后充分水洗；

12、蘇木素復染，水洗返藍；

13、酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片；

14，顯微鏡下觀察拍照。

原位雜交

客戶提供:

1. 組織樣本材料要新鮮，組織離體后應立即投入固定液（10％中性甲醛、4％多聚甲醛，）中；

2. 細胞樣本離心后棄去上清液加入3%戊二醛固定液；

3. 石蠟切片，冰凍切片以及細胞爬片，涂片等請按照溫度要求運輸、儲存。

提交的產品和資料:

1. 雜交后的切片；

2. 每張切片提供一張照片；

3. 實驗報告