上海Western blot實(shí)驗(yàn)

蛋白印跡，也稱Western，Western blot、Western blotting、Western印跡，是用抗體檢測(cè)蛋白的重要方法之一。蛋白印跡可以參考如下步驟進(jìn)行操作。
1. 蛋白樣品的制備(Protein sample preparation)
    可以選用適當(dāng)?shù)牧呀庖?，裂解貼壁細(xì)胞、懸浮細(xì)胞或組織樣品。對(duì)于某些特定的亞細(xì)胞組份蛋白，例如細(xì)胞核蛋白、細(xì)胞漿蛋白、線粒體蛋白等，可以參考相關(guān)文獻(xiàn)提取這些亞細(xì)胞組份蛋白，也可以使用試劑盒進(jìn)行蛋白抽提。
2. 電泳

(1) SDS-PAGE凝膠配制

SDS-PAGE凝膠可以參考文獻(xiàn)資料進(jìn)行配制。

(2) 樣品處理

    在收集的蛋白樣品中加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，于100℃或沸水浴中加熱3-5分鐘，以充分變性蛋白。使用濃縮的蛋白上樣緩沖液可以減小上樣體積，在相同體積的上樣孔內(nèi)可以加入更多的蛋白樣品。蛋白上樣緩沖液可以參考相關(guān)文獻(xiàn)資料自行配制。

(3) 上樣與電泳

    冷卻到室溫后，把蛋白樣品直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)即可。為了便于觀察電泳效果和轉(zhuǎn)膜效果，以及判斷蛋白分子量大小，好使用預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)。電泳時(shí)通常在上層膠時(shí)使用低電壓恒壓電泳，而在溴酚藍(lán)進(jìn)入下層膠時(shí)使用高電壓恒壓電泳。對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)電泳裝置或類似電泳裝置，低電壓可以設(shè)置在80-100V，高電壓可設(shè)置在120V左右。標(biāo)準(zhǔn)電泳裝置或類似電泳裝置，低電壓可以設(shè)置在80-100V，高電壓可設(shè)置在120V左右。
    采用普通的電泳儀就可以滿足SDS-PAGE電泳的要求。為方便起見，也可整個(gè)SDS-PAGE電泳過程均采用恒壓的方式，通常把電壓設(shè)置在100V，然后設(shè)定時(shí)間為90－120分鐘。設(shè)置定時(shí)可以避免經(jīng)常發(fā)生的電泳過沖。通常電泳時(shí)溴酚藍(lán)到達(dá)膠的底端處附近即可停止電泳，或根據(jù)預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)的電泳情況，預(yù)計(jì)目的蛋白已經(jīng)被適當(dāng)分離后即可停止電泳。

上海Western blot實(shí)驗(yàn)
3. 轉(zhuǎn)膜(Transfer)
    轉(zhuǎn)膜時(shí)，具體的轉(zhuǎn)膜時(shí)間要根據(jù)目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的轉(zhuǎn)膜時(shí)間越長(zhǎng)，目的蛋白的分子量越小，需要的轉(zhuǎn)膜時(shí)間越短。如使用Bio-Rad的標(biāo)準(zhǔn)濕式轉(zhuǎn)膜裝置，轉(zhuǎn)膜電流可設(shè)定為80V/2H or 10V過一晚。
   在轉(zhuǎn)膜過程中，特別是高電流快速轉(zhuǎn)膜時(shí)，通常會(huì)有非常嚴(yán)重的發(fā)熱現(xiàn)象，好把轉(zhuǎn)膜槽放置在冰浴中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜效果可以通過預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)觀察轉(zhuǎn)膜效果，通常分子量大的1-2條帶較難全部轉(zhuǎn)到膜上。轉(zhuǎn)膜效果也可以用麗春紅染色液對(duì)膜進(jìn)行染色，以觀察實(shí)際的轉(zhuǎn)膜效果。也可以用考馬斯亮藍(lán)染色液對(duì)轉(zhuǎn)膜后的PAGE膠進(jìn)行染色，以觀察蛋白的殘留情況。

4. 封閉(Blocking) 
    轉(zhuǎn)膜完畢后，立即把蛋白膜放置到預(yù)先準(zhǔn)備好的悅延生物WB洗膜液中，漂洗1-2分鐘，以洗去膜上的轉(zhuǎn)膜液。從轉(zhuǎn)膜完畢起，以后的步驟均要注意膜的保濕，避免膜的干燥，否則極易產(chǎn)生較高的背景?？捎冒退固匚芪M洗滌液，加入WB封閉液，在搖床上緩慢搖動(dòng),室溫封閉60分鐘。如背景較高，可以在4℃ 封閉過一晚。在整個(gè)Western過程中可使用側(cè)擺搖床，側(cè)向擺動(dòng)速度比較緩慢，而且也容易讓溶液覆蓋蛋白膜。

5. 一抗孵育(Primary antibody incubation)
    參考文獻(xiàn)，按比例用WB一抗稀釋液適當(dāng)稀釋一抗。用巴斯特吸管吸盡封閉液，不要漂洗，直接加入稀釋好的一抗，室溫側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)孵育一小時(shí)在再37℃水箱一小時(shí)。如果效果不佳，可以在4℃緩慢搖動(dòng)孵育過一晚?；厥找豢梗尤隬B洗滌液，在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)洗滌5-10分鐘。洗凈洗滌液后，再加入WB洗滌液，，漂洗3-6次，每次5-10分鐘。如果結(jié)果背景較高可以適當(dāng)延長(zhǎng)漂洗時(shí)間并增加漂洗次數(shù)。
6. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation)
    參考文獻(xiàn)，按照適當(dāng)比例用WB二抗稀釋液稀釋辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗。用巴斯特吸管吸盡洗滌液，立即加入稀釋好的二抗，室溫或4℃在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)孵育一小時(shí)?；厥斩?，加入WB洗滌液，在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)洗滌5-10分鐘。洗凈洗滌液后，再加入洗滌液，漂洗3-5次，每次5-10分鐘。如果顯色結(jié)果背景較高，可以適當(dāng)延長(zhǎng)洗滌時(shí)間并增加洗滌次數(shù)。
7. 蛋白檢測(cè)(Detection of proteins)
    檢測(cè)結(jié)果可使用相應(yīng)顯色試劑來檢測(cè)蛋白，具體使用細(xì)節(jié)請(qǐng)參考相關(guān)文獻(xiàn)。.
8. 膜的重復(fù)利用(Membrane recovery)
    如果蛋白樣品非常寶貴，可以使用悅延生物WB抗體去除液處理蛋白膜，以重復(fù)利用蛋白膜。
9.您需提供
    需新鮮或正存的蛋白樣品或者蛋白粗提液，陽(yáng)性對(duì)照樣品（如果有）， 檢測(cè)目的蛋白的一抗（或由悅延生物代購(gòu)）。組織樣品不少于50mg；細(xì)胞不少于5×106個(gè)；總蛋白濃度不低于 2μg/μl（至少50μl）。