單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序簡(jiǎn)介：10x Genomics 是基于微流控技術(shù)的單細(xì)胞系統(tǒng)，可同時(shí)獲得100-800000個(gè)細(xì)胞的表達(dá)信息，實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞群體的劃分與細(xì)胞群體間基因表達(dá)差異的檢測(cè)，是腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性、免疫細(xì)胞群體檢測(cè)以及胚胎發(fā)育研究的黃金方法。10xGenomics單細(xì)胞應(yīng)用廣泛，可應(yīng)用的細(xì)胞類型有：生殖細(xì)胞，胚胎細(xì)胞，神經(jīng)細(xì)胞，免疫細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞，干細(xì)胞，其他原代細(xì)胞。

1  單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序實(shí)驗(yàn)流程

1.1實(shí)驗(yàn)流程圖

1.2實(shí)驗(yàn)描述

1) 細(xì)胞質(zhì)檢RNA，用Countess®II Automated Cell Counter對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)，將細(xì)胞濃度調(diào)整到理想濃度1×106/mL。

2) 10x 標(biāo)記cDNA的片段，含有barcode信息的凝膠珠子首先與細(xì)胞和酶的混合物結(jié)合，然后被位于微流體'雙十字'連接中的油表面活性劑液滴包裹。液滴非常小，僅能容納一個(gè)凝膠珠子，液滴流到儲(chǔ)液器中被收集后，凝膠珠子溶解釋放引物序列，逆轉(zhuǎn)錄cDNA的片段，并以cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。將每個(gè)液滴中含有barcode信息的產(chǎn)物混合，構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)。

3) 建庫(kù)，首先利用Biorupter 超聲破碎儀將cDNA 打斷成200~300bp左右的片段，加上測(cè)序接頭P5 和測(cè)序引物R1 等傳統(tǒng)二代測(cè)序的建庫(kù)過(guò)程，后進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到DNA 文庫(kù)。

4) 簇生成和測(cè)序，利用Qubit 儀器對(duì)文庫(kù)進(jìn)行定量，合格的文庫(kù)被放置到cBot中進(jìn)行橋式擴(kuò)增，生成簇后利用Hiseq 或者M(jìn)iseq測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。原理是每個(gè)循環(huán)都加入A，T，G，C 4 種熒光基團(tuán)標(biāo)記的dNTP，依據(jù)AT、GC 配對(duì)，對(duì)應(yīng)的dNTP通過(guò)1DNA 聚合酶結(jié)合到模板DNA 鏈上，其他未結(jié)合的dNTP被洗脫掉，結(jié)合的位置釋放出熒光信號(hào)，被計(jì)算機(jī)捕捉到并進(jìn)行相應(yīng)轉(zhuǎn)換，從而得到該位置的堿基信息。