裸鼠皮下成瘤模型構建

一、模型構建流程與核心技術

1. 實驗動物選擇

• 品系選擇：

• 常用品系：BALB/c nu/nu裸鼠（T細胞缺陷）、NOD-SCID（T/B/NK細胞缺陷）、NSG（NOD-SCID-IL2Rγ-/-，全免疫缺陷）。

• 性別與周齡：優先選擇雄性裸鼠（6-8周齡，體重18-20 g），減少激素干擾。

• 飼養條件：SPF級環境，溫度22-25℃，濕度40-70%，12小時光照/黑暗周期。

2. 腫瘤細胞準備

• 細胞株選擇：

• 高成瘤細胞：HCT-116（結直腸癌，成瘤率100%）、SKOV3（卵巢癌）、SGC-7901（胃癌）。

• 爭議性細胞：如Hep-G2（肝癌）需高細胞密度（1×10? cells/只）接種。

• 細胞預處理：

• 傳代要求：取對數生長期細胞（活力>95%），胰酶消化后離心（1000 rpm，5分鐘），重懸于PBS或基質膠（Matrigel）中（體積比1:1）。

• 濃度調整：常規接種濃度1×10?~1×10? cells/mL（具體依細胞株特性調整）。

3. 皮下接種操作

• 注射部位：

• 腋下：右腋皮下（淋巴引流明確，便于觀察轉移）。

• 背部：中線兩側（避免動物抓撓）。

• 操作步驟：

1. 麻醉：1%戊ba比妥鈉（50 mg/kg）或異氟烷吸入麻醉。

2. 注射：使用1 mL注射器（22-25G針頭），緩慢注入0.1-0.2 mL細胞懸液（避免滲漏）。

3. 退針后輕壓注射點，防止細胞液反流。

4. 術后監測與數據記錄

• 成瘤時間：

• 快速成瘤型：HCT-116（7天可見結節）。

• 慢速成瘤型：原代細胞或低侵襲性細胞需2-4周。

• 監測指標：

• 腫瘤體積：游標卡尺測量長徑（L）和短徑（W），按公式V=1/2×L×W2計算。

• 動物狀態：體重變化、活動度、腫瘤潰瘍情況。

二、模型評價體系與驗證方法

1. 成瘤率與生長曲線

• 成功標準：瘤體體積≥100 mm3（通常接種后2-4周）。

• 生長曲線分析：繪制腫瘤體積-時間曲線，計算倍增時間（如HCT-116約3天）。

2. 組織病理學驗證

• HE染色：觀察腫瘤細胞異型性、核分裂象及間質浸潤。

• 免疫組化：檢測Ki-67（增殖指數）、CD31（微血管密度）等標志物。

3. 分子生物學檢測

• 基因表達：qPCR或Western blot驗證目標基因（如PRDX4、ASAP1）在瘤體中的表達。

• 信號通路分析：檢測PI3K/AKT、VEGF等通路關鍵蛋白。

4. 功能成像技術

• 小動物PET/CT：18F-FDG示蹤腫瘤代謝活性。

• 活體熒光成像：適用于標記熒光素酶（Luc）的腫瘤細胞。

三、技術優化與常見問題解決

1. 提高成瘤率的策略

• 細胞預處理：

• 基質膠混合：增強細胞黏附與血管生成（如SKOV3聯合Matrigel）。

• 低溫操作：細胞懸液全程冰上保存，減少凋亡。

• 動物選擇優化：

• 年輕裸鼠：4-6周齡代謝活躍，成瘤更快。

• 免疫強化品系：NSG小鼠適用于低成瘤性細胞。

2. 常見問題與解決方案

3. 特殊模型構建技巧

• 原位移植模型：

• 皮下傳代后切取瘤塊（1 mm3）移植至靶器官（如胃壁），模擬轉移。

• 基因編輯模型：

• CRISPR/Cas9敲除目標基因（如KMT2D）后接種，研究基因功能。

四、應用場景與案例分析

1. 抗腫瘤藥物篩選

• 案例：卡培他濱抑制HCT-116裸鼠瘤體生長，腫瘤體積減少60%。

• 評價指標：瘤重抑制率=（對照組瘤重-實驗組瘤重）/對照組瘤重×100%。

2. 基因功能研究

• 案例：sh-PRDX4組瘤體體積較對照組下降50%，證實PRDX4促癌作用。

• 驗證方法：shRNA慢病毒轉染+皮下成瘤。

3. 轉移機制探索

• 案例：過表達miR-449a抑制Bel-7402肝癌細胞轉移，肺轉移灶減少80%。

• 技術延伸：結合淋巴結解剖與HE染色分析轉移率。

五、倫理規范與實驗設計

1. 倫理原則

• 3R原則：

• 替代（Replacement） ：優先使用體外模型預實驗。

• 減少（Reduction） ：每組≥5只裸鼠（統計學意義）。

• 優化（Refinement） ：術中麻醉+術后鎮痛（布洛芬5 mg/kg）。

2. 實驗記錄標準化

• 數據記錄：詳細記錄接種時間、細胞批次、動物編號。

• 病理存檔：瘤體福爾馬林固定或液氮凍存，供后續分析。

六、總結與未來方向

裸鼠皮下成瘤模型因其操作簡便、成本可控和高重復性，成為腫瘤研究的核心工具。未來發展趨勢包括：

1. 多組學整合：單細胞測序解析瘤內異質性。

2. 動態監測技術：納米探針聯合micro-CT實現微轉移灶無創檢測。

3. 人源化升級：PDX（人源腫瘤異種移植）模型替代傳統CDX模型，提高臨床預測性。